Оценка функциональной пригодности лиофилизата таргетных каркасных белков с анкириновыми повторами для радионуклидной визуализации гиперэкспрессии HER2/neu в злокачественных опухолях

Abstract

Цель - изучить in vitro и in vivo функциональную пригодность лиофилизата таргетных каркасных белков с анкириновыми повторами DARPin G3-(GGGS)3Cys, меченых 99mTc, для радионуклидной визуализации гиперэкспрессии HER2/neu в злокачественных опухолях. Материалы и методы. Для наработки таргетного белка использовали модифицированную генетическую конструкцию с последовательностью, кодирующей белок DARPin G3-(GGGS)3Cys. Для получения экспериментального препарата использовали лиофилизат, содержащий DARPin G3-(GGGS)3Cys со вспомогательными веществами, и раствор натрия пертехнетата, 99mТс (500 МБк) при инкубации 60 °С, 30 мин. Анализ радиохимической чистоты (РХЧ) 99mTс-G3-(GGGS)3Cys проводили тонкослойной радиохроматографией. Для оценки специфичности in vitro использовали клеточные линии: SKOV-3 более BT-474 более DU-145. Константу диссоциации определяли с помощью анализа насыщения на SKOV-3 в диапазоне концентраций белка от 0,2 до 40 нМ. Для оценки таргетных свойств и биораспределения использовали мышей линии Nu/j, несущих ксенотрансплантаты SKOV-3 (HER2/neu позитивные) и ксенотрансплантаты Ramos (HER2/neu негативные). Результаты. Получен радиокомплекс на основе 99mTс и лиофилизата таргетных белков DARPin G3(GGGS)3Cys с РХЧ более 96%. Связывание 99mTс-G3-(GGGS)3Cys с клетками является специфичным c KD 3,9 ± 0,5 нМ и пропорционально уровню экспрессии HER2/neu в клетках. Поглощение 99mTс-G3-(GGGS)3Cys в ксенотрансплантатах SKOV-3 было значимо выше, чем в ксенотрансплантатах Ramos. 99mTсG3-(GGGS)3Cys продемонстрировал быстрое выведение из крови, почечный клиренс, низкие уровни активности в слюнных железах и желудке. Уровень накопления активности в печени составил около 5-7 %ВД/г. Кроме того, 99mTс-G3-(GGGS)3Cys имел очень низкое поглощение в легких, мышцах, тонком кишечнике и костях. Заключение. Лиофилизат таргетных каркасных белков DARPin G3-(GGGS)3Cys, меченый 99mTc, функционально пригоден для визуализации гиперэкспрессии HER2/neu в опухолях, поскольку специфически связывается с рецептором, стабилен in vivo и имеет благоприятное биораспределение в органах и тканях. Радиокомплекс 99mTс-G3-(GGGS)3Cys получен по простой процедуре с высокой радиохимической чистотой.Aim. To study in vitro and in vivo the functional suitability of 99mTc-labeled lyophilized formulation containing designed ankyrin repeat protein (DARPin) G3-(GGGS)3Cys for radionuclide imaging of HER2/neu overexpression in malignant tumors. Materials and methods. To create a targeted protein, a modified genetic construct with the sequence encoding DARPin G3-(GGGS)3Cys was used. To generate the experimental probe, we used a lyophilized formulation containing DARPin G3-(GGGS)3Cys with auxiliary substances and 99mTc sodium pertechnetate (500 MBq) incubated at 60 °C for 30 min. Radiochemical purity of 99mTc-G3-(GGGS)3Cys was analyzed by thin-layer radiochromatography. SKOV-3, BT-474, and DU-145 cell lines were used to test binding specificity in vitro. The dissociation constant was determined via a saturation binding assay on SKOV-3 cells with a range of protein concentrations from 0.2 to 40 nM. Nu/j mice bearing HER2-positive SKOV-3 xenografts and HER2-negative Ramos xenografts were used to evaluate the targeting properties and biodistribution. Results. A radiocomplex based on 99mTc and a lyophilized formulation with DARPin G3-(GGGS)3Cys was obtained with the radiochemical purity of more than 96%. Binding of 99mTc-G3-(GGGS)3Cys to the cells was specific (KD 3.9 ± 0.5 nM) and proportional to the level of HER2/neu expression in the cells. The uptake of 99mTc-G3-(GGGS)3Cys in SKOV-3 xenografts was significantly higher than in Ramos xenografts. 99mTc-G3-(GGGS)3Cys demonstrated rapid blood and renal clearance and had low activity in the salivary glands and stomach. Liver uptake was about 5-7%ID/g. In addition, 99mTc-G3-(GGGS)3Cys exhibited very low uptakes in the lungs, muscles, small intestine, and bones. Conclusion. The 99mTc-labeled lyophilized formulation with DARPin G3-(GGGS)3Cys is functionally suitable for imaging HER2/neu overexpression in tumors, as it binds specifically to the receptor, is stable in vivo, and has favorable biodistribution in organs and tissues. The radiocomplex based on 99mTc-G3-(GGGS)3Cys was obtained by a simple method with high radiochemical purity.