Молекулярные механизмы влияния N-этилмалеимида и 1,4-дитиоэритритола на регуляцию апоптоза опухолевых клеток линии Р19 при гипоксии

Abstract

Актуальность. Нарушение регуляции апоптоза в эпителиальных опухолевых клетках линии Р19 сопряжено с формированием окислительного стресса. В условиях гипоксии происходит изменение функционирования митохондрий, что может выступать дополнительным фактором, усугубляющим окислительный стресс в опухолевой клетке. Цель - оценить влияние N-этилмалеимида и 1,4-дитиоэритритола на реализацию и регуляцию апоптоза опухолевых клеток линии Р19 при гипоксии in vitro. Материалы и методы. Материалом для исследования служили культивированные в условиях гипоксии опухолевые клетки линии Р19 (тератокарцинома мыши). Для модуляции редокс-статуса использовали N-этилмалеимид в концентрации 5 мМ и протектор SH-групп - 1,4-дитиоэритритол в конечной концентрации 5 мМ. Методом проточной цитофлуориметрии определяли внутриклеточное содержание ионов кальция, трансмембранный потенциал митохондрий, количество аннексин V-, CD95- и CD120-положительных клеток. Концентрацию восстановленного, окисленного и белково-связанного глутатиона, SH-групп протеинов, гидроксильного радикала и карбонильных производных белков измеряли методом спектрофотомерии. Результаты. В условиях гипоксии изменение редокс-статуса системы глутатиона, сопровождающееся окислительной модификацией белков (глутатионилирование и карбонилирование), оказывает влияние на метаболизм опухолевой клетки в целом и, при применении протектора SH-групп белков - 1,4-дитиоэритритола, способствует формированию дополнительных механизмов ускользания от клеточной гибели, а в случае применения блокатора SH-групп протеинов - N-этилмалеимида - активации апоптоза. Заключение. В условиях гипоксии изменение редокс-гомеостаза опухолевой клетки и модуляция окислительной модификации белков (глутатионилирование и карбонилирование) являются одним из перспективных подходов таргетной регуляции клеточной гибели.

Relevance. Impairment of apoptosis regulation in P19 cells is correlated with generation of oxidative stress. Under hypoxia, changes in mitochondrial functions occur, which may exacerbate oxidative stress in the tumor cell. The aim of the study was to evaluate the effects of N-ethylmaleimide and 1,4-dithioerythritol on implementation and regulation of apoptosis in P19 cells under hypoxia in vitro. Materials and methods. P19 cells (mouse teratocarcinoma) cultured under hypoxia served as the material for the study. For redox status modulation, 5mM N-ethylmaleimide and 1,4-dithioerythritol in the final concentrations of 5 mM were used. The intracellular concentration of calcium ions, the transmembrane potential and the number of Annexin V, CD95 and CD120 positive cells were determined by flow cytometry. The levels of reduced, oxidized and protein-bound glutathione, protein SH groups, hydroxyl radical and protein carbonyl derivatives were measured by spectrophotometry. Results. The alteration in the redox status of the glutathione system under hypoxia, accompanied by oxidative modification of proteins (glutathionylation and carbonylation), influences the metabolism in the tumor cell on the whole. Under the effects of 1,4-dithioerythritol, an SH group protector, this alteration promotes formation of additional mechanisms to escape apoptosis, whereas under the effects of N-ethylmaleimide, an SH group blocker, it, on the contrary, promotes apoptosis activation. Conclusions. The changes in the redox homeostasis of the tumor cell and modulation of oxidative modification of proteins (glutathionylation and carbonylation) under hypoxia are one of the promising approaches to targeted regulation of cell death.