Функциональный анализ новой мутации сплайсинга c.2067+2TG в гене MYBPC3 при гипертрофической кардиомиопатии

Abstract

Цель - исследование патогенного эффекта варианта в сайте сплайсинга MYBPC3 у пациента с гипертрофической кардиомиопатией. Материалы и методы. Исследование проведено с использованием образца ДНК пациентки с гипертрофической кардиомиопатией, у которой был выявлен ранее не описанный вариант в донорном сайте сплайсинга интрона 21. Применены методы конструирования и клонирования мини-генов (вектор pSpl3- Flu2-TKdel), трансфекции культуры клеток человека (HEK293T), с последующим выделением мРНК, получением кДНК, ПЦР участка мини-гена, содержащего анализируемый фрагмент, электрофореза в агарозном геле, секвенирования по Сэнгеру. Результаты. Вариант chr11:47339649-A-C (hg38), нарушающий донорный сайт сплайсинга в интроне 21 (NM_000256.3: c.2067+2T более G), был выявлен у пациентки 23 лет с обструктивной формой гипертрофической кардиомиопатии. Для прямого анализа влияния этого варианта на сплайсинг был получен вектор, содержащий экзон 21, интрон 21, экзон 22, частично интроны 20 и 22 MYBPC3. Сравнение мРНК, полученных для мини-генов, содержащих или несодержащих исследуемый вариант, показало, что замена chr11:47339649-A-C приводит к пропуску экзонов 21 и 22 в процессе сплайсинга. Заключение. В результате исследования установлена функциональная значимость ранее не описанного варианта c.2067+2T более G в гене MYBPC3, приводящего к нарушению механизма сплайсинга мРНК у пациента с гипертрофической кардиомиопатией. Данный вариант может быть классифицирован как патогенный.Aim. To study the pathogenic effect in the MYBPC3 splice-site variant in the patient with hypertrophic cardiomyopathy. Materials and methods. The study was conducted using a DNA sample obtained from a patient with hypertrophic cardiomyopathy, in whom a previously undescribed variant was identified in the splice donor site of intron 21. The methods used included constructing and cloning of minigenes (vector pSpl3-Flu2-TKdel) and transfection of a human cell culture (HEK293T), followed by isolation of mRNA, production of cDNA, PCR of the minigene region containing the analyzed fragment, agarose gel electrophoresis, and Sanger sequencing. Results. The chr11:47339649-A-C (hg38) variant, disrupting the splice donor site in intron 21 (NM_000256.3: c.2067+2T more G), was identified in the 23-year-old patient with obstructive hypertrophic cardiomyopathy. To directly analyze the effect of this variant on splicing, a vector containing exon 21, intron 21, exon 22, and partially introns 20 and 22 of the MYBPC3 gene was obtained. A comparison of mRNAs from the minigenes containing / not containing the variant showed that the chr11:47339649-A-C substitution led to exon 21 and exon 22 skipping during splicing. Conclusion. The study established the functional significance of the previously undescribed variant c.2067+2T more G in the MYBPC3 gene, resulting in disruption of the mRNA splicing mechanism in the patient with hypertrophic cardiomyopathy. This variant can be classified as pathogenic.