Исследование транскриптома плоскоклеточного рака головы и шеи после протонного облучения

Abstract

Цель - оценить изменения транскриптома клеток ткани плоскоклеточного рака головы и шеи (ПРГШ) у пациентов после протонного облучения. Материалы и методы. Биопсийный материал, полученный от трех пациентов ПРГШ до и после протонного облучения в суммарной дозе 10 изоГр, был подвергнут гомогенизации, очистке и концентрации. После чего была выделена тотальная РНК с последующей очисткой и концентрацией набором RNA Clean & Concentrator (Zymo Research), количество оценивали с помощью прибора Qubit 2.0 (Invitrogen, Life Technologies). После выделения тотальной РНК из 1 мкг для секвенирования на платформе Illumina были приготовлены библиотеки с использованием набора TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 с этапом обогащения в 10 циклов в соответствии с рекомендациями производителя. Качество РНК и полученных библиотек проверялось с помощью системы капиллярного электрофореза Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Tec. Inc., США). Параметр RIN для РНК составлял не менее 7. Концентрацию библиотек оценивали с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени на приборе CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, США). Окончательные библиотеки объединяли в эквимолярных пропорциях перед секвенированием на платформе Illumina HiSeq 2500 с использованием парно-концевых прочтений по 50 оснований. Параметр Q20 для всех образцов составил более 97%, а количество прочтений в среднем равнялось 60,2 млн на образец. Сырые прочтения были обработаны с использованием RTA 1.17.21.3 и Casava 1.8.2 (Illumina). Анализ обогащения был выполнен с помощью программного обеспечения PANTHER 17.0.Результаты. В ходе транскриптомного анализа ПРГШ после пятикратного облучения пациентов протонами (2 изоГр) в суммарной дозе 10 изоГр было обнаружено 1 414 значимо дифференциально экспрессированных генов. Выделены 10 наиболее и наименее экспрессируемых генов и ассоциированные с ними сигнальные пути. В ПРГШ после облучения протонами обнаружен ряд сигнальных путей, связанных с низкоэкспрессированными генами, таких как STAT5; сигнальный путь PD-1; отмечена MET-опосредованная активация сигнального пути PTK2, передача сигналов PDGF; CD22-опосредованная регуляция BCR; активация MAPK, опосредованная FCERI. Кроме вышеназванных сигнальных путей обращает на себя внимание активация процесса распада коллагена, FCGR3A-опосредованного фагоцитоза и FCGR3A-опосредованного синтеза интерлейкина-10 (IL10). При анализе обогащения среди высокоэкспрессируемых генов в ткани ПРГШ после протонного облучения были активированы процессы ороговения и биологического окисления. Заключение. Облучение протонами при ПРГШ приводит к гиперэкспрессии генов, вовлеченных в регуляцию процессов ороговения и биологического окисления; гипоэкспрессии генов, связанных с подавлением сигнальных путей: STAT5, PD-1, MET-опосредованной активации сигнального пути PTK2, передачи сигналов PDGF; CD22-опосредованной регуляции BCR; активации MAPK, опосредованной FCERI, процесса распада коллагена, активации FCGR3A-опосредованного фагоцитоза и FCGR3A-опосредованного синтеза IL10. Все сигнальные пути гипоэкспрессированных генов функционируют в клетках ПРГШ, если негативного влияния на опухоль не оказывается извне (облучение или поступление противоопухолевых препаратов). Преобладание подавленных сигнальных путей над активированными, вероятнее всего, свидетельствует о снижении функционального потенциала клеток после облучения протонами. Дозозависимость эффектов ПТ обусловливает необходимость дальнейшего изучения изменений клеточных и молекулярно-генетических сигнатур ПРГШ после протонного облучения разными дозами.Aim. To evaluate changes in the transcriptome of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) tissue cells in patients after proton therapy. Materials and methods. Biopsy material obtained from 3 HNSCC patients before and after proton therapy at a total dose of 10 isoGy was homogenized, purified, and concentrated. Then total RNA was isolated with further purification and concentration with the RNA Clean & Concentrator kit (Zymo Research). Library quantitation was assessed using the Qubit 2.0 instrument (Invitrogen, Life Technologies). After isolation of 1 μg total RNA for sequencing, libraries were prepared on the Illumina platform using the TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 with a 10-cycle enrichment step according to the manufacturer's recommendations. The quality of RNA and the resulting libraries was checked using the Agilent 2100 Bioanalyzer system (Agilent Tec. Inc., USA). The RIN parameter for RNA was at least 7. The library concentration was assessed by real-time PCR on the CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, USA). Final libraries were pooled in equimolar ratios before sequencing on the Illumina HiSeq 2500 platform using 50 base-pair paired-end reads. The Q20 parameter for all samples was more 97%, and the number of reads averaged 60.2 million per sample. Raw reads were processed using the RTA 1.17.21.3 and Casava 1.8.2 (Illumina). The enrichment analysis was performed using the PANTHER 17.0 software. Results. The transcriptome analysis of HNSCC after proton radiation therapy (5 x 2 isoGy) at a total dose of 10 isoGy revealed 1,414 significantly differentially expressed genes. The 10 most and least expressed genes and their associated signaling pathways were identified. A number of signaling pathways associated with the underexpressed genes were detected in HNSCC after proton therapy, such as: STAT5; PD-1 signaling pathway; marked MET-mediated activation of PTK2 signaling pathway, PDGF signaling; CD22-mediated regulation of BCR; and FCERI-mediated MAPK activation. In addition to the above signaling pathways, activation of collagen degradation, FCGR3A-mediated phagocytosis, and FCGR3A-mediated interleukin (IL)-10 synthesis are of interest.

In the enrichment analysis among highly expressed genes, keratinization and biological oxidation processes were activated in HNSCC tissues after proton therapy. Conclusion. Proton therapy in HNSCC leads to overexpression of genes involved in the regulation of keratinization and biological oxidation processes as well as to underexpression of genes associated with suppression of signaling pathways: STAT5, PD-1, MET-mediated activation of PTK2 signaling pathway, PDGF signaling; CD22-mediated regulation of BCR; FCERI-mediated MAPK activation, collagen degradation, FCGR3A-mediated phagocytosis activation, and FCGR3A-mediated IL-10 synthesis. All signaling pathways of underexpressed genes function in HNSCC cells if there is no negative influence on the tumor from outside (irradiation or delivery of antitumor drugs). The predominance of suppressed signaling pathways over activated ones most likely indicates a decrease in the functional potential of cells after proton therapy. The dose-dependence of PT effects necessitates further study of changes in cellular and molecular-genetic signatures of HNSCC after proton irradiation with different doses.