Разработка и характеристика ксенотрансплантатов, полученных от пациентов с колоректальным раком, для тестирования новых фармакологических субстанций

Abstract

Цель. Создание модели ксенотрансплантата, полученного от пациента с колоректальным раком (КРР), и определение ее гистологических и молекулярных характеристик, таких как статус генов KRAS, NRAS BRAF и наличие микросателлитной нестабильности. Материалы и методы. Для создания первого поколения модели in vivo использовали опухоли от пациентов с КРР (n = 4) и иммунодефицитных мышей линии Balb/c Nude (n = 20), для создания второ¬го, третьего и четвертого поколения - мышей этой же линии (n = 3 для каждого поколения). Измерения подкожных ксенотрансплантатов выполняли штангенциркулем, их размеры вычисляли по формуле Шрека для эллипсоида. Криоконсервацию выполняли путем погружения образцов в микс для криоконсервации (80% RPMI 1640, 10% фетальной бычьей сыворотки, 10% диметилсульфоксида) и хранения их на -80 °C. Гистологическое исследование выполняли согласно стандартной методике (приготовление парафиновых блоков и окрашивание микросрезов гематоксилином и эозином). Мутации в генах KRAS, NRAS и BRAF определяли методом прямого секвенирования по Сэнгеру, микросателлитную нестабильность - методом фрагментарного анализа по пяти локусам: Bat-25, Bat-26, NR21, NR24, NR27. Результаты. Стабильные перевиваемые ксенотрансплантаты КРР получены от двух пациентов из четырех. Среднее время ожидания между имплантацией и ростом трансплантата первого поколения составило 28 сут. Латентная фаза после криоконсервации была сопоставима с латентной фазой при создании первого поколения пациентоподобной модели. Показано, что в модели воспроизведены гистотип, степень дифференцировки и мутационный статус генов KRAS, NRAS, BRAF и микросаттелитная нестабильность донорской опухоли. Заключение. Созданная модель КРР человека охарактеризована с учетом динамики роста, способности переносить криоконсервацию, гистологических и молекулярно-генетических параметров.

The aim of the study was to create a patient-derived xenograft (PDX) model of human colorectal cancer and to determine its histologic and molecular characteristics, such as the status of KRAS, NRAS, and BRAF genes and the presence of microsatellite instability. Materials and methods. First generation xenograft models in vivo were created using tumors from patients with colorectal cancer (n = 4) and immunodeficient Balb/c Nude mice (n = 20): second, third, and fourth generation models were created in the same mouse line (n = 3 for each generation). A caliper was used to measure subcutaneous xenografts: their size was calculated by the ellipsoid formula. Cryopreservation involved immersing the samples in a freezing medium (80% RPMI 1640, 10% fetal bovine serum, 10% dimethyl sulfoxide (DMSO)) and storing them at -80 °C. The histologic analysis was performed according to the standard technique (preparation of paraffin blocks and staining of microsections with hematoxylin and eosin). Mutations in the KRAS, NRAS, and BRAF genes were determined by direct Sanger sequencing: microsatellite instability was determined by the fragment analysis at five loci: Bat-25, Bat-26, NR21, NR24, and NR27. Results. Stable, transplantable xenografts of colorectal cancer were obtained from two out of four patients. The average waiting time from the implantation to the growth of the first generation xenograft was 28 days. The latency phase after cry opreservation was comparable to that at the creation of the first generation PDX model. The model reproduced the histotype, grade and mutational status of the KRAS, NRAS, and BRAF genes, as well as micro satellite instability of the donor tumor. Conclusion. The developed model of human colorectal cancer was characterized in terms of growth dynamics, cryopreservation tolerance, and histologic and molecular genetic parameters.