Роль окислительной модификации белков в редокс-регуляции активности каспазы-3 в лимфоцитах крови при окислительном стрессе in vitro

Abstract

В основе патогенеза многих распространенных и социально-значимых заболеваний лежит формирование окислительного стресса. Лимфоциты крови являются клетками, обеспечивающими иммунологический контроль организма. В результате происходит контакт лимфоцитов крови с различными эндогенными и экзогенными факторами, что может приводить к интенсификации продукции активных форм кислорода, окислительной модификации макромолекул и изменению выживаемости клеток. Актуальным является расширение и углубление фундаментальных знаний об особенностях регуляции апоптоза лимфоцитов крови. Цель исследования - установить взаимосвязь между изменением состояния системы глутатиона, уровнем карбонилирования, глутатионилирования белков и активностью каспазы-3 в лимфоцитах крови при окислительном стрессе in vitro. Материал и методы. Материалом для исследования служили лимфоциты крови, культивированные с добавлением пероксида водорода в конечной концентрации 0,5 ммоль и (или) блокатора SH-групп протеинов N-этилмалеимида - 5 ммоль, протектора - 5 ммоль - 1,4-дитиоэритритола. Методом спектрофотометрии определяли концентрацию восстановленного, окисленного и белково-связанного глутатиона, дополнительно рассчитывали величину соотношения восстановленной фракции тиола к окисленной. С помощью иммуно-ферментного анализа оценивали уровень карбонильных производных протеинов, активность каспазы-3 регистрировали спектрофлюориметрическим методом. Результаты. Блокирование SH-групп протеинов в лимфоцитах крови при окислительном стрессе in vitro сопровождалось резким падением концентрации белково-связанного глутатиона на фоне увеличения содержания карбонильных производных белков и активности каспазы-3. Протекция SH-групп белков в лимфоцитах крови при окислительном стрессе in vitro сопровождалась возрастанием концентрации белково-связанного глутатиона, карбонильных производных протеинов при сопоставимых значениях активности изучаемого фермента. Выводы. Проведенные исследования свидетельствуют о том, что каспаза-3 и белково-связанный глутатион являются молекулярными мишенями селективного управления программированной клеточной гибелью. Полученные показатели изменения активности каспазы-3 и концентрации белково-связанного глутатиона в лимфоцитах крови при окислительном стрессе in vitro могут быть использованы при разработке подходов таргетной терапии заболеваний, сопровождающихся дисрегуляцией апоптоза.

The formation of oxidative stress lies at the heart of many frequent and socially-important diseases. Blood lymphocytes are the cells which provide immunological control of our organism. As a result of their function implementation blood lymphocytes contact with different endogenic and exogenic factors, which can lead to active oxygen species production activation, macromolecules oxidative modification and to cell survival alteration. At the present time it is essential to expand and deepen the fundamental knowledge of blood lymphocytes apoptosis regulation peculiarities. The research objective was to establish the interaction among alterations of glutathione system condition, carbonylation level, protein glutathionylation and caspase-3 activity in blood lymphocytes during oxidative stress in vitro. Material and Methods. The material for research was blood lymphocytes cultivated with addition of hydrogen peroxide in final concentration of 0,5 mmol and/or protein SH-group inhibitor Nethylmaleimide – 5 mmol, protector – 5 mmol – 1,4-dithioerythritol. Reduced, oxidized and protein-bound glutathione concentration was measured by method of spectrophotometry, additionally, the ratio size of reduced to oxidized thiol fraction was estimated. With help of enzymoimmunoassay the level of protein carbonyl derivatives was evaluated; caspase-3 activity was registered by spectrofluorometric method. Results. Protein SH-group blocking in blood lymphocytes during oxidative stress in vitro was accompanied by protein-bound glutathione concentration rapid decrease in connection with increase of protein carbonyl derivatives content and caspase-3 activity. Protein SH-group protection in blood lymphocytes during oxidative stress in vitro was accompanied by concentration increase of protein-bound glutathione and protein carbonyl derivatives under comparable values of enzyme activity under study. Conclusion. The carried out research shows that caspase-3 and protein-bound glutathione are the molecular targets of selective control over programmed cell death. The received indices of caspase-3 activity change and protein-bound glutathione concentration alteration in blood lymphocytes during oxidative stress in vitro can be used when elaborating target therapy approaches to diseases accompanied by apoptosis disregulation.